Phänotypisierung in chemischen Reaktionen

Reaktionsphänotypisierungsstudien bewerten den Einfluss von Enzym-Isoform-spezifischen Inhibitoren auf das Verschwinden eines Elterntestartikels, der in gepoolten menschlichen Lebermikrosomen inkubiert wurde. Die Inkubation mit rekombinanten Isoformen einzelner metabolisierender Arzneimittelenzyme liefert eine Bestätigung der Enzymaktivitäten. Die Bewertung der Enzyme, die für die Metabolisierung eines Testartikels verantwortlich sind, kann potenzielle Herausforderungen aufzeigen, wie Stoffwechselwege, die durch einzelne Enzyme oder durch polymorph exprimierte Enzyme katalysiert werden.

Behördliche Erwägungen für Reaktionsphänotypisierungsstudien

Die Untersuchung von CYP-Enzymen (CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2D6 und CYP3A) wird als erste Untersuchung empfohlen, um die Eliminierungswege des Wirkstoffs gemäß den Richtlinien zu Wirkstoffwechselwirkungen besser zu verstehen. Wenn diese wichtigen CYP-Enzyme nicht am Metabolismus des Wirkstoffs beteiligt sind, sollten andere Phase I- und Phase II-Enzyme bewertet werden, einschließlich:

  • CYP-Enzyme (CYP2A6, CYP2J2, CYP4F2 und CYP2E1)
  • Nicht-CYP-Enzyme, einschließlich Aldehydoxidase (AO), Carboxylesterase (CES), Monoaminoxidase (MAO), Flavinmonooxygenase (FMO), Xanthinoxidase (XO) und Alkohol/Aldehyddehydrogenase (ADH/ALDH)
  • Konjugative Enzyme, einschließlich UDP-Glucuronosyltransferasen (UGT) und Sulfotransferasen (SULT)

Die Reaktionsphänotypisierung liefert Informationen über die von Testartikeln metabolisierte Fraktion und kann verwendet werden, um das Potenzial für Wirkstoffwechselwirkungen zu bewerten, das klinische Studiendesign zu informieren, die individuelle Variabilität in der Pharmakokinetik vorherzusagen und die Auswirkungen des genetischen Polymorphismus zu bewerten.


Methoden

  • Testsystem: Gepoolte humane Lebermikrosomen und rekombinante individuell exprimierte menschliche Enzyme mit den erforderlichen Cofaktoren
  • CYP-Isoformen: CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 und CYP3A4. (Andere CYP, UGT und Wirkstoffmittelmetabolisierungsenzyme sind ebenfalls erhältlich).
  • Zur Bestätigung werden Isoform-spezifische chemische Inhibitoren und rekombinante Enzyme verwendet.

Der Testartikel wird mindestens 5 Minuten mit Mikrosomen in Phosphatpuffer vorinkubiert. Der Metabolismus des Testartikels wird durch Zugabe von NADPH oder einem anderen geeigneten Cofaktor initiiert. Die Inkubationen werden durch Zugabe eines organischen Lösungsmittels beendet und die Proben werden dann unter Verwendung von Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) auf den Testartikel und/oder seine Metaboliten analysiert.

Phase I – Optimierung der In-vitro-Inkubationsbedingungen

Der Testartikel wird dreifach mit einem Bereich von Mikrosomenkonzentrationen (typischerweise 0,1–1 mg Protein/ml) für vier Zeitpunkte bis zu 60 Minuten inkubiert, in Gegenwart von NADPH oder einem anderen geeigneten Cofaktor.

Kontrollinkubationen werden in Abwesenheit eines Cofaktors durchgeführt. Inkubationsbedingungen der mikrosomalen Konzentration und des Zeitpunkts, die eine lineare Rate des Verschwindens des Testartikels erzeugen, werden verwendet, um Folgeexperimente zu definieren.

Phase II – Kinetische Analyse des Metabolismus von Testartikeln

Die Geschwindigkeit, mit der der Testartikel verschwindet, wird in den Inkubationsproben mit mindestens acht Konzentrationen des Testartikels in dreifacher Ausführung unter optimierten Bedingungen überwacht. Die Daten werden unter Verwendung der Michaelis-Menten-Kurvenanpassung analysiert und die kinetischen Parameter Km und Vmax werden für den Testartikel bestimmt.

Phase III – Inhibitionsanalyse mit CYP-spezifischen chemischen Hemmstoffen

Der Testartikel wird dreifach bei einer Konzentration m mit gepoolten menschlichen Lebermikrosomen in Abwesenheit oder Gegenwart der enzymselektiven chemischen Hemmstoffe inkubiert. Kontrollinkubationen werden in Abwesenheit des Hemmstoffs nur unter Verwendung von Vehikellösungsmittel durchgeführt.

Phase IV – Metabolismus unter Verwendung rekombinanter menschlicher CYP

Der Testartikel wird dreifach bei einer Konzentration m mit einer Reihe von rekombinanten menschlichen CYP und UGT sowie anderen DME (siehe oben) inkubiert. Es wird die relative Konzentration des Testartikels nach 0 und 60 Minuten gemessen. 

Ergebnisse

Diese Assays identifizieren Enzyme, die für das Ausmaß des Metabolismus des Testartikels in-vitro verantwortlich sind, und das Ausmaß des Metabolismus. Es wird die Kinetik des Verschwindens des Testartikels und/oder der Metabolitenbildung bestimmt.  Die In-vitro-Metabolismusbewertung identifiziert die wichtigsten beteiligten Enzyme und weist auf mögliche Herausforderungen des In-vivo-Eliminierungsmechanismus vor dem ersten Test am Menschen hin.