Proteinbindung

Nach dem Eintritt eines Wirkstoffs in den und seinem Erscheinen im systemischen Kreislauf kann nur die freie und ungebundene Fraktion eine pharmakologische (oder toxikologische) Wirkung entfalten. Das Ausmaß der Plasmaproteinbindung kann in-vitro oder ex-vivo durch Gleichgewichtsdialyse, Ultrafiltration oder Ultrazentrifugation bestimmt werden. Die Teilung eines Testartikels in Erythrozyten gegenüber Plasma kann in-vitro oder ex-vivo in tierischem und menschlichem Blut bestimmt werden. Die mikrosomale Proteinbindung kann durch Gleichgewichtsdialyse evaluiert werden. Für die Evaluierung pharmakologischer, pharmakokinetischer und toxikologischer Daten werden Daten benötigt, die beschreiben, wie sich der Wirkstoff an Plasmaproteine bindet und wie die Blut-Plasma-Teilung funktioniert.

Behördliche Überlegungen zur Plasmaproteinbindung, zur Blut-Plasma-Teilung und zu mikrosomalen Proteinbindungsstudien

Die Untersuchung der Plasma- oder Mikrosomalprotein-ungebundenen Fraktion eines Testartikels ist entscheidend für die Charakterisierung des pharmakokinetischen In-vivo-Profils von Dosis, Exposition, Wirksamkeit und Sicherheitsmargen in der klinischen Pharmakologie. Die artenübergreifende Bewertung der Plasmaproteinbindung ist eine IND-Anforderung und wird in den ICH M3(R2)-Leitlinien detailliert beschrieben.



Verfahren zur Plasmaproteinbindung
  • Testsystem: Gepooltes Plasma von jeder Spezies oder spezifische Plasmaproteinlösungen (z. B. humanes Serumalbumin, α1-Säureglykoprotein, Gamma-Globulin)
  • Die Konzentrationen werden so gewählt, dass sie bekannte klinische Expositionen einklammern (0,1–10X Cmax), sofern sie nicht durch die Löslichkeit begrenzt sind.

Gleichgewichtsdialyse

Die Gleichgewichtsdialyse wird mit einem Hochdurchsatz-Dialysegerät (HTDialysis LLC, Gales Ferry, CT) durchgeführt.  Eine angereicherte Matrix (entweder Plasma oder isoliertes Plasmaprotein) wird in die Spenderkammer gegeben, während Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) in die Rezeptorkammer jeder Mulde gegeben wird. Die Platten werden dann mit einer gasdurchlässigen Membran versiegelt und bei 37 °C in 5 % CO2 für die vorgesehene Zeit inkubiert (siehe unten). Nach der Inkubation werden die Proben aus jeder Kammer mit Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) analysiert.

  • Stabilität in der Matrix: Der Testartikel wird in Plasma und in DPBS bei einer einzigen Konzentration von bis zu fünf Zeitpunkten inkubiert.
  • Zeit zum Gleichgewicht: Der Testartikel wird dem Plasma in einer einzigen Konzentration zugesetzt und für bis zu fünf Zeitpunkte gegen DPBS dialysiert.
  • Abhängigkeit der Proteinbindungskonzentration: Der Testartikel wird dem Plasma in drei Konzentrationen zugesetzt und für die zur Herstellung des Gleichgewichts erforderliche Zeit gegen DPBS dialysiert. 
  • Eine Positivkontrolle wie Warfarin wird in paralleler Gleichgewichtsdialyse für ≥5 Stunden getestet.

Ultrafiltration

Angereichertes Plasma wird dem Probenreservoirteil einer Ultrafiltrationsvorrichtung mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 30.000 Da hinzugefügt. Die Proben werden bei 37 °C und 2.000 × g für 15 Minuten zentrifugiert (oder andere geeignete Bedingungen). Nach der Zentrifugation wird das Ultrafiltrat mittels LC-MS auf Testartikel und Inhalt im Vergleich zu den Ausgangskonzentrationen analysiert. Alle Proteinbindungsbestimmungen werden dreifach durchgeführt. 

  • Unspezifische Bindung: Der Testartikel wird zum Kontrollplasma-Ultrafiltrat (PUF) in zwei Konzentrationen hinzugefügt und nach dem Ultrafiltrationsverfahren zentrifugiert. Das Dialysat wird analysiert, um die Erholung des Testartikels und eine mögliche unspezifische Bindung in Abwesenheit von Plasma zu bestimmen.
  • Abhängigkeit der Proteinbindungskonzentration: Der Testartikel wird dem Plasma in fünf Konzentrationen zugesetzt und nach dem Ultrafiltrationsverfahren zentrifugiert. Das Ultrafiltrat wird auf Testartikel analysiert.

Ultrazentrifugation

Angereichertes Plasma wird in die Ultrazentrifugenröhrchen gegeben und bei 37 ºC bei 223.000 × g für 4 Stunden zentrifugiert (oder andere geeignete Bedingungen), um die Trennung des Plasma-Ultrazentrifugats vom Plasmaprotein zu erreichen. Nach der Zentrifugation wird das Ultrazentrifugat mittels LC-MS analysiert und mit den Ausgangskonzentrationen verglichen. 

  • Unspezifische Bindung: Testartikel wird zum menschlichen Kontrollplasma und Plasma-Ultrafiltrat (PUF) in zwei Konzentrationen hinzugefügt und in Ultrazentrifugenröhrchen für 4 Stunden inkubiert. Die Matrix wird analysiert, um die Erholung des Testartikels und eine mögliche unspezifische Bindung in Abwesenheit von Plasma zu bestimmen.
  • Abhängigkeit der Proteinbindungskonzentration: Der Testartikel wird dem Plasma in fünf Konzentrationen zugesetzt und nach dem Ultrazentrifugationsverfahren zentrifugiert. Das Ultrazentrifugat wird auf Testartikel analysiert.
Verfahren zur Blut-Plasma-Teilung

BPP-Studien werden verwendet, um die In-vitro-Blut-zu-Plasma-Teilung eines Testartikels im Blut von verschiedenen Spezies, einschließlich Menschen, zu bestimmen.

  • Testsystem: Das von jeder Tierart gewonnene Blut kann von mindestens drei Spendern gepoolt werden. Menschliches Blut, das von mindestens drei Freiwilligen gewonnen wurde, wird nicht gepoolt.
  • Hämatokritwerte werden für die gepoolten Tierblutproben und die einzelnen menschlichen Blutproben bestimmt.
  • Das Blut wird bei 2–8 °C gelagert und so bald wie möglich innerhalb von 1 Woche nach Erhalt verwendet. 

Der Testartikel wird dem Blut zugesetzt und es werden erste zu untersuchende Teilmengen, Aliquote, entnommen. Angereichertes Blut wird wie angegeben bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation werden Aliquote zur Analyse entnommen. Verbleibendes Blut wird zentrifugiert, um Plasma zu gewinnen; Aliquote werden zur Analyse gesammelt und mit den ursprünglichen Aliquoten verglichen.

  • Stabilität in der Matrix: Der Testartikel wird für bis zu vier Zeitpunkte in einer einzigen Konzentration in Blut inkubiert.
  • Zeit zum Gleichgewicht: Der Testartikel wird dem Blut in einer einzigen Konzentration für bis zu vier Zeitpunkte zugesetzt.
  • Abhängigkeit der Proteinbindungskonzentration: Der Testartikel wird dem Blut bei bis zu 5 Konzentrationen zugesetzt und bis zum Gleichgewichtszeitpunkt inkubiert.

Bei radioaktiv markierten Testartikeln werden Blutaliquote vor der Flüssigszintillationszählung (LSC) aufgelöst. Bei nicht radioaktiv markierten Testartikeln werden die Blutaliquote vor der Extraktion und Analyse mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) lysiert.

Verfahren zur mikrosomalen Proteinbindung

Eine Bewertung des Potenzials eines Testartikels, sich in-vitro an das mikrosomale Protein der menschlichen Leber zu binden, ermöglicht die Korrektur der ungebundenen Fraktion in Assays, die diese Systeme verwenden.

Die Gleichgewichtsdialyse wird in Triplikaten mit einem Hochdurchsatz-Dialysegerät (HTDialysis LLC, Gales Ferry, CT) durchgeführt.  Angereicherte Mikrosomen werden in die Spenderkammer gegeben, während ein Assay-Puffer in die Empfängerkammer jeder Mulde gegeben wird. Die Platten werden dann mit einer gasdurchlässigen Membran versiegelt und bei 37 °C in 5 % CO2 für 5 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation werden die Proben aus jeder Kammer mit Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) analysiert.

  • Proteinbindung: Humane Lebermikrosomen werden auf drei Konzentrationen (0.05, 0.1, 0,5 mg/mL) in Phosphatpuffer verdünnt. Der Testartikel wird dann den Mikrosomen in drei Konzentrationen für insgesamt 9 Proben zugesetzt. Angereicherte Matrixproben werden in dreifacher Ausführung in HTD-Spenderkammern überführt und 5 Stunden lang gegen Phosphat dialysiert.
  • Stabilität in Mikrosomen: Angereicherte Matrixproben von oben werden bei 37 °C in 5 % CO2 für 0 und 5 Stunden inkubiert.

 

Ergebnisse

Anhand von Plasmaprotein-Bindungsassays wird das Ausmaß der Bindung des Testartikels ermitteln, wobei ein Prozentsatz der gebundenen und ungebundenen Artikel, die Zeit bis zum Dialysegleichgewicht und das Konzentrationsabhängigkeitsprofil beim Menschen und anderen ausgewählten präklinischen Spezies ermittelt werden. Die Blut-Plasma-Teilung liefert einen Teilungskoeffizienten. Diese Daten können dann zur Berechnung der freien Fraktion im Plasma verwendet werden, um eine Korrektur der In-vivo-Expositionen für die Profilierung der Wirksamkeits- und Sicherheitsmargen zu ermöglichen.  

Mittels mikrosomaler Protein-Bindungsassays wird das Ausmaß der Bindung des Testartikels an mikrosomale Proteine der menschlichen Leber ermittelt, um IC50 oder andere Parametern zur Berücksichtigung der freien Wirkstofffraktion zu korrigieren.