Das Verschwinden einer Ausgangsverbindung oder das Auftreten von Metaboliten wird nach Inkubation mit Hepatozyten, Lebermikrosomen oder Plasma gemessen, was die Berechnung der Halbwertszeit und der intrinsischen Clearance ermöglicht. Danach kann die Biotransformation von Testartikel- und Metabolitenprofilen aufgeklärt werden.
Diese Studien werden verwendet, um die Halbwertszeit der Verbindung zu messen, die intrinsische Clearance zu berechnen und menschliche Pharmakokinetik-Profile in Erwartung von first-in-human-Versuchen vorherzusagen.
Der Testartikel wird in zwei Konzentrationen mit etwa 1 x 106 Hepatozyten/ml, suspendiert in Williams E-Medium für bis zu 5 Zeitpunkte inkubiert und durch Zugabe von organischem Lösungsmittel gestoppt.
Kontrollinkubationen werden nur im Inkubationsmedium durchgeführt, um die Stabilität des Testartikels unter Inkubationsbedingungen zu bestimmen. Die metabolische Integrität jeder Hepatozytencharge wird mit 7-Ethoxycumarin oder einem anderen geeigneten Marker bewertet.
Der Testartikel wird bei zwei Konzentrationen für bis zu 5 Zeitpunkte in Plasma inkubiert und durch Zugabe eines organischen Lösungsmittels gestoppt. Positive Kontrollinkubationen sind unter anderem Procain (hydrolysiert durch Carboxylesterase) oder ein anderer geeigneter metabolischer Marker.
Der Testartikel wird in zwei Konzentrationen mit Mikrosomen (0,5 mg/ml Protein) in Gegenwart von NADPH für bis zu 5 Zeitpunkte inkubiert und durch Zugabe eines organischen Lösungsmittels gestoppt. Kontrollinkubationen werden in Abwesenheit von NADPH durchgeführt, um die Stabilität des Testartikels unter Inkubationsbedingungen zu bestimmen.
Die metabolische Integrität jeder Mikrosomencharge wird für Phase-1-Enzyme unter Verwendung von 7-Ethoxycumarin oder eines anderen geeigneten Markers bewertet.
Inkubationsproben werden unter Verwendung einer Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS)-Analysemethode auf den verbleibenden Testartikel analysiert. Der Prozentsatz des verbleibenden Testartikels in den Proben wird dann im Vergleich zur Anfangskonzentration bestimmt. Nach der Genehmigung können ausgewählte Proben weiter analysiert werden, um Metaboliten durch LC-MS zu charakterisieren oder zu identifizieren.
Diese Assays liefern Informationen zur Wirkstoffstabilität (berechnet anhand der Halbwertszeit und der intrinsischen Clearance) unter Verwendung von zellulären oder subzellulären Fraktionen. Eine weitere Analyse der Inkubationen zur Erstellung und Identifizierung von Metaboliten kann die Biotransformationswege aufklären und einen besseren Vergleich zwischen präklinischen Testspezies und menschliche Metaboliten ermöglichen.
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