Enzyminhibition

Die Hemmung von Cytochrom P450 (CYP)- und UGT-Enzymen ist eine Hauptursache für klinisch relevante Wirkstoff-Wechselwirkungen (siehe DDI). Das Hemmpotential eines Testobjekts wird bewertet, indem seine Wirkung auf den Metabolismus selektiver Sondensubstrate für humane CYP-Enzyme in gepoolten Inkubationen auf Basis von menschlichen Lebermikrosomen bestimmt wird. Die inhibitorische Enzymkinetik kann weiter charakterisiert und die resultierenden Daten können verwendet werden, um vorherzusagen, ob nach Verabreichung des Wirkstoffes ein klinisch signifikanter DDI auftreten kann. 

Behördliche Überlegungen für Enzymhemmungsstudien

Diese Studien werden sowohl von den FDA- als auch von den EMA-Richtlinien für Wirkstoff-Wechselwirkungen (DDI) empfohlen, um Daten zur reversiblen (direkten) und irreversiblen (zeitabhängigen) Cytochrom-P450 -Hemmung zu generieren, bevor sie bei first-in-human-Versuchen angewendet werden. Inhibitionsdaten werden zur Bestimmung des Bedarfs und des Umfangs klinischer DDI-Studien verwendet.


Methode

  • Testsystem: Gepoolte menschliche Lebermikrosomen (HLM)
  • Bewertete CYP-Enzyme: CYP1A2, CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 und CYP3A4/5
  • UGT-Enzyme, die auf Anfrage in direkten Inhibitionstests bewertet wurden: UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT11A6, UGT1A9, UGT2B7, UGT2B15 
  • Testartikelkonzentrationen: 8 Konzentrationen in dreifacher Ausführung
  • Alle Probenvorbereitungen und Inkubationen werden mit einem automatisierten Liquid-Handling-System von Hamilton Microlab Star durchgeführt

Die CYP-Hemmung wird sowohl in direkten als auch in abhängigen Assays gemessen. Ein CYP-selektives Substrat wird in einer Substratkonzentration verwendet, die die Hälfte der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit (Km) für jedes CYP-Enzym erreicht (siehe unten). Bekannte Inhibitoren werden als positive Kontrollen sowohl für direkte als auch für metabolismusabhängige Inhibitionstests verwendet. Alle Inkubationen werden durch Zugabe von gekühltem Acetonitril beendet, das einen stabil markierten internen, für das CYP-Substrat spezifischen Metabolitenstandard enthält.

Direkte Hemmung

Assays werden ohne und mit 8 Konzentrationen des Testartikels durchgeführt, um das Inhibitionspotential zu bestimmen und wo möglich einen IC50 zu definieren.

Die direkte Hemmung kann weiter charakterisiert werden, indem die Hemmkonstante (Ki) und die Art der beobachteten Hemmung unter Verwendung von 5 Konzentrationen des Sondensubstrats bestimmt wird.

Zeitabhängige (irreversible) Hemmung

Assays unter Verwendung von 8 Konzentrationen des Testartikels werden mit und ohne NADPH für 30 Minuten vor der Verdünnung in eine Sondensubstrat-Testmischung inkubiert. Wenn eine deutliche, zeitabhängige Hemmung beobachtet wird, können zusätzliche kinetische Parameter bestimmt werden, einschließlich der Inaktivierungskonstante (kinact) und der Hemmkonstante (KI). Diese Parameter, die experimentell durch Variation der Vorinkubationszeit und der Inhibitorkonzentration bestimmt werden, können dabei helfen, das Potenzial für Wirkstoff-Wechselwirkungen zu definieren.

CYP-Inhibitionstestbedingungen

 

 

 

Positive Kontrollen

Cytochrom P450

Substrat

Analyt

Direkte Hemmung

Zeitabhängige Hemmung

CYP1A2

Phenacetin

Acetaminophen

Fluvoxamin

Furafyllin

CYP2B6

Bupropion

Hydroxybupropion

Orphenadrin

ThioTEPA

CYP2C8

Amodiaquin

Desethylamodiaquin

Montelukast

Gemfibrozil 1-O-β-Glucuronid

CYP2C9

Diclofenac

4'-Hydroxydiclofenac

Sulfaphenazol

Tienilsäure

CYP2C19

Mephenytoin

4'-Hydroxymephenytoin

Nootkaton

Esomeprazol

CYP2D6

Dextrometorphan

Dextrorphan

Chinidin

Paroxetin

CYP3A4/5

Testosteron

6β-Hydroxytestosteron

Ketoconazol

Erythromycin

CYP3A4/5

Midazolam

1'-Hydroxymidazolam

Ketoconazol

Troleandomycin

 

Ergebnisse

Diese Assays liefern IC50-Werte für die direkte oder irreversible Hemmung von CYP-Enzymen. Wenn eine signifikante direkte Hemmung beobachtet wird, kann die Hemmkonstante (Ki) bestimmt werden. Wenn eine signifikante zeitabhängige Hemmung beobachtet wird, können die mechanismusbasierten Inaktivierungsparameter (KI und kinact) bestimmt werden. Mit diesen Parametern kann die Pharmakometrie zusätzliche Hinweise bei der Beurteilung der Notwendigkeit einer klinischen Studie geben.