Enzyminduktion

Die Induktion von CYP-Enzymen (typischerweise CYP1A2, CYP2B6 und CYP3A4) wird in-vitro nach Exposition gegenüber dem Testartikel in Monolayer-Kulturen menschlicher Hepatozyten gemessen.

In ersten Experimenten sollte das Potenzial zur Induktion der Enzyme CYP1A2, CYP2B6 und CYP3A4 untersucht werden. Wenn die Induktion von CYP3A4-Enzymen beobachtet wird, sollte der Sponsor auch das Induktionspotential der CYP2C-Enzyme (CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19) bewerten. Die Effekte werden dann mit denen verglichen, die durch Positivkontrollinduktoren der untersuchten CYP-Enzyme hervorgerufen werden. Darüber hinaus können Ex-vivo-Tierlebern (typischerweise von Maus, Ratte, Hund oder Affe) zu subzellulären Fraktionen verarbeitet und verwendet werden, um die durch den Testartikel vermittelten Effekte auf Wirkstoffmetabolisierungsenzyme nach der In-vivo-Verabreichung während Sicherheitsbeurteilungsstudien zu bewerten.

• Testsystem: Individuelle menschliche Spenderhepatozyten, kryokonserviert
• CYP-Enzyme bewertet: CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4/5.
• Testartikel-Konzentrationen: Ausgewählt zur Einklammerung der vorhergesagten klinischen Expositionen (0,1 bis 10X C_max), sofern nicht durch die Löslichkeit begrenzt. Wählen Sie 5 Konzentrationen für die Zytotoxizität, 7 für die mRNA-Induktion und 3 für die Induktion der Enzymaktivität.
• Inkubationszeit: 72 Stunden, mit aufgefrischten Medien alle 24 Stunden.

Zytotoxizität

In vorbereitenden Assays werden Hepatozyten von einem Spender in Gegenwart des Testartikels (fünf Konzentrationen) oder Positivkontroll-Tamoxifen (50 µM) in dreifachen Vertiefungen für 72 Stunden in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C in 5 % CO2 kultiviert, mit Austausch des Mediums ± Testartikel oder Kontrollen alle 24 Stunden. Nach 72 Stunden wird die Lebensfähigkeit der Hepatozyten mit dem MTS-Assay bewertet. Die Ergebnisse werden zur Bestimmung ungiftiger Testartikelkonzentrationen für die Induktionsassays verwendet.

Stabilität

In Verbindung mit dem Zytotoxizitäts-Assay werden Medienproben gesammelt, um die Konzentrationen des Testartikels über die Zeit zu bewerten.

CYP-mRNA-Induktion

Hepatozyten von drei Spendern werden in Anwesenheit oder Abwesenheit des Testartikels (sieben Konzentrationen) oder der Kontrollinduktoren (siehe unten) in dreifachen Vertiefungen für 72 Stunden in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C in 5 % CO2 inkubiert, mit Austausch des Mediums ± Testartikel oder Kontrollen alle 24 Stunden. Nach 72 Stunden wird die mRNA extrahiert und die Genexpression mittels quantitativer Echtzeit-PCR bestimmt. Das Niveau jeder CYP-mRNA wird auf das Niveau eines endogenen Kontrollgens (z. B. GAPDH) normalisiert. Die Faltungsinduktion der CYP-Genexpression wird dann mit der 2-ΔΔCT-Methode berechnet. Testartikel-abhängige Erhöhungen der CYP-mRNA-Spiegel um mindestens das 2-Fache relativ zur Vehikelkontrolle oder eine Reaktion von ≥20 % der Reaktion der Positivkontrollen können als positive Ergebnisse interpretiert werden.

CYP-Enzyminduktion

Hepatozyten von drei Spendern werden in Anwesenheit oder Abwesenheit des Testartikels (drei Konzentrationen) oder der Kontrollinduktoren (wie oben) in dreifachen Vertiefungen für 72 Stunden in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C in 5 % CO2 gezüchtet, mit Austausch des Mediums ± Testartikel oder Kontrollen alle 24 Stunden. Nach 72 Stunden werden die Hepatozyten in frischem Medium, das geeignete CYP-Substrate (siehe unten) enthält, für 2 Stunden inkubiert. Danach werden die Reaktionen beendet und Proben für die Analyse der Metaboliten (siehe unten) mit einer Analysemethode der Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) gesammelt. Testartikel-abhängige Erhöhungen der CYP-Enzymaktivität um mindestens das 2-Fache relativ zur Vehikelkontrolle oder eine Reaktion von ≥20 % der Reaktion der Positivkontrollen können als positive Ergebnisse interpretiert werden.

Ergebnisse

Diese Assays werden mRNA- und Enzymaktivitätswerte im Vergleich zu bekannten Induktoren von CYP-Enzymen liefern. Die EC₅₀ und E_max werden zur Verfügung gestellt, falls anwendbar.

Wenn positive Ergebnisse beobachtet werden, kann Pharmakometrie eine zusätzliche Hilfestellung bei der Beurteilung der Notwendigkeit einer klinischen Studie geben.