Enzyminduktion

Bei der Untersuchung der Stoffwechseleigenschaften Ihres Wirkstoffs sollten Sie auch Enzyminduktionsstudien einbeziehen, um mögliche Probleme bei der Erzielung wirksamer Plasmakonzentrationen von gleichzeitig verabreichten Medikamenten aufzuzeigen, wenn Ihr Wirkstoff eine Enzymexpression induziert oder verstärkt. Die Enzyminduktion kann zu erhöhter metabolischer Clearance oder Toxizität führen, die durch eine stärkere systemische Exposition von aktiven Metaboliten verursacht wird. 

Die Induktion von CYP-Enzymen (typischerweise CYP1A2, CYP2B6 und CYP3A4) wird in-vitro nach Exposition gegenüber dem Testartikel in Monolayer-Kulturen menschlicher Hepatozyten gemessen.

In ersten Experimenten sollte das Potenzial zur Induktion der Enzyme CYP1A2, CYP2B6 und CYP3A4 untersucht werden. Wenn die Induktion von CYP3A4-Enzymen beobachtet wird, sollte der Sponsor auch das Induktionspotential der CYP2C-Enzyme (CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19) bewerten. Die Effekte werden dann mit denen verglichen, die durch Positivkontrollinduktoren der untersuchten CYP-Enzyme hervorgerufen werden. Darüber hinaus können Ex-vivo-Tierlebern (typischerweise von Maus, Ratte, Hund oder Affe) zu subzellulären Fraktionen verarbeitet und verwendet werden, um die durch den Testartikel vermittelten Effekte auf Wirkstoffmetabolisierungsenzyme nach der In-vivo-Verabreichung während Sicherheitsbeurteilungsstudien zu bewerten.

Behördliche Überlegungen für Enzyminduktionsstudien

Diese Studien werden sowohl von den FDA- als auch von den EMA-Richtlinien für Wirkstoff-Wirkstoff-Interaktionen (DDI) empfohlen, um die Cytochrom-P450-Induktion für CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8}, CYP2C9, CYP2C19 und CYP3A4 zu bewerten, bevor sie zu First-in-human-Versuchen gehen.

Induktionsdaten werden zur Bestimmung des Bedarfs und des Umfangs klinischer DDI-Studien verwendet.

 

Methode

  • Testsystem: Individuelle menschliche Spenderhepatozyten, kryokonserviert
  • CYP-Enzyme bewertet: CYP1A2, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4/5.
  • Testartikel-Konzentrationen: Ausgewählt zur Einklammerung der vorhergesagten klinischen Expositionen (0,1 bis 10X Cmax), sofern nicht durch die Löslichkeit begrenzt. Wählen Sie 5 Konzentrationen für die Zytotoxizität, 7 für die mRNA-Induktion und 3 für die Induktion der Enzymaktivität.
  • Inkubationszeit: 72 Stunden, mit aufgefrischten Medien alle 24 Stunden.

Zytotoxizität

In vorbereitenden Assays werden Hepatozyten von einem Spender in Gegenwart des Testartikels (fünf Konzentrationen) oder Positivkontroll-Tamoxifen (50 µM) in dreifachen Vertiefungen für 72 Stunden in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C in 5 % CO2 kultiviert, mit Austausch des Mediums ± Testartikel oder Kontrollen alle 24 Stunden. Nach 72 Stunden wird die Lebensfähigkeit der Hepatozyten mit dem MTS-Assay bewertet. Die Ergebnisse werden zur Bestimmung ungiftiger Testartikelkonzentrationen für die Induktionsassays verwendet.

Stabilität

In Verbindung mit dem Zytotoxizitäts-Assay werden Medienproben gesammelt, um die Konzentrationen des Testartikels über die Zeit zu bewerten.

CYP-mRNA-Induktion

Hepatozyten von drei Spendern werden in Anwesenheit oder Abwesenheit des Testartikels (sieben Konzentrationen) oder der Kontrollinduktoren (siehe unten) in dreifachen Vertiefungen für 72 Stunden in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C in 5 % CO2 inkubiert, mit Austausch des Mediums ± Testartikel oder Kontrollen alle 24 Stunden. Nach 72 Stunden wird die mRNA extrahiert und die Genexpression mittels quantitativer Echtzeit-PCR bestimmt. Das Niveau jeder CYP-mRNA wird auf das Niveau eines endogenen Kontrollgens (z. B. GAPDH) normalisiert. Die Faltungsinduktion der CYP-Genexpression wird dann mit der 2-ΔΔCT-Methode berechnet. Testartikel-abhängige Erhöhungen der CYP-mRNA-Spiegel um mindestens das 2-Fache relativ zur Vehikelkontrolle oder eine Reaktion von ≥20 % der Reaktion der Positivkontrollen können als positive Ergebnisse interpretiert werden.

CYP-Enzyminduktion

Hepatozyten von drei Spendern werden in Anwesenheit oder Abwesenheit des Testartikels (drei Konzentrationen) oder der Kontrollinduktoren (wie oben) in dreifachen Vertiefungen für 72 Stunden in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C in 5 % CO2 gezüchtet, mit Austausch des Mediums ± Testartikel oder Kontrollen alle 24 Stunden. Nach 72 Stunden werden die Hepatozyten in frischem Medium, das geeignete CYP-Substrate (siehe unten) enthält, für 2 Stunden inkubiert. Danach werden die Reaktionen beendet und Proben für die Analyse der Metaboliten (siehe unten) mit einer Analysemethode der Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) gesammelt. Testartikel-abhängige Erhöhungen der CYP-Enzymaktivität um mindestens das 2-Fache relativ zur Vehikelkontrolle oder eine Reaktion von ≥20 % der Reaktion der Positivkontrollen können als positive Ergebnisse interpretiert werden.

 

 

 

Enzymaktivitäts-Assays

CYP-Enzym

Induktor

Nicht-Induktor

Substrat

Analyt

CYP1A2

Omeprazol

Flumazenil

Phenacetin

Acetaminophen

CYP2B6

Phenobarbital

Flumazenil

Bupropion

Hydroxybupropion

CYP3A4/5

Rifampicin

Flumazenil

Midazolam

1’-Hydroxymidazolam

 

Ergebnisse

Diese Assays werden mRNA- und Enzymaktivitätswerte im Vergleich zu bekannten Induktoren von CYP-Enzymen liefern. Die EC50 und Emax werden zur Verfügung gestellt, falls anwendbar.

Wenn positive Ergebnisse beobachtet werden, kann Pharmakometrie eine zusätzliche Hilfestellung bei der Beurteilung der Notwendigkeit einer klinischen Studie geben.