Arzneimittel-Wechselwirkungen und Transporter

Membran-Arzneimitteltransporter, die sich in vielen Barrieregeweben des Körpers befinden, können mit Arzneimitteln interagieren, um die Absorption, Verteilung und Elimination in-vivo zu beeinflussen, und sind die Ursache für klinisch relevante Arzneimittel-Arzneimittel-Wechselwirkungen (DDIs). Die Identifizierung des Testartikels als Substrat oder Inhibitor von Transportern kann klinisch relevante veränderte Expositionen und Toxizitäten von gleichzeitig verabreichten Arzneimitteln erklären.

Die Darmpermeabilität eines Arzneimittels ist ein wichtiger Faktor für die absorbierte Fraktion und kann unter Verwendung des Caco-0-Monolayer-Transportassays bewertet werden.

Regulatorische Überlegungen zu Transporterinteraktionen

Diese Studien werden sowohl von den FDA- als auch von den EMA-Richtlinien für Arzneimittel-Wechselwirkungen (DDI) empfohlen, um die Transporter-Wechselwirkungen zu bewerten, bevor erste Studien am Menschen durchgeführt werden. Transporterstudien zeigen mögliche Probleme bei der Erzielung wirksamer Plasmakonzentrationen von gleichzeitig verabreichten Medikamenten aufgrund des Einflusses eines Arzneimittels auf die Absorption oder Verteilung auf.

Mehrere Transporter interagieren mit Arzneimitteln im klinischen Einsatz. Zu den zum Testen empfohlenen gehören:

  • Effluxtransporter der ATP-Bindungskassette (ABC) P-Glycprotein (P-gp), Brustkrebsresistenzprotein (BCRP) und Gallensalzexportpumpe (BSEP).
  • Aufnahmetransporter für gelöste Träger (SLC) Organischer Anionentransporter (OAT) 1 und OAT3, Organischer Kationentransporter (OCT) 2, Organisches Anionentransportpolypeptid (OATP) 1B1, OATP1B3 und Multidrug- und Toxinextrusion (MATE) 1 und MATE2 K.

Methoden für Transporterinteraktionen:

Aufnahme-Transporter-Assay
  • Testsystem: Transfizierte Zelllinien, die einen SLC-Transporter oder eine Vektorkontrolle exprimieren, gezüchtet in Monoschichten in einem angefeuchteten Inkubator bei 37 °C in 5 % CO2.
  • Testpuffer: HBSS mit HEPES, pH 7,4
  • Nur für MATE-Transporter werden die Zellen mit NH4Cl vorbehandelt, um einen pH-Gradienten über die Zellmembran einzuführen, der für die MATE-Aufnahmeaktivität erforderlich ist
  • Testartikelkonzentrationen: 2 für Substrattests, 2 für Inhibitionstests
  • Radiomarkierte Sondensubstrate, die für jeden Transporter spezifisch sind
  • Positive Kontrollinhibitoren für jeden Transporter

Transporter-exprimierende Zellen in Kultur werden mit einem Assay-Buffer für 30 Minuten in einem angefeuchteten Inkubator bei 37 °C in 5 % CO2 vorinkubiert. MATE-exprimierende Zellen werden mit NH4Cl behandelt, um einen pH-Gradienten über der Zellmembran zu erzeugen und die Aufnahmeaktivität zu erleichtern. Ein Sondensubstrat oder ein Testgegenstand wird zu dreifachen Vertiefungen gegeben, und gegebenenfalls werden Inhibitoren hinzugefügt. Die Platten werden je nach Transporter für einen Zeitpunkt von 2 bis 10 Minuten inkubiert. Der Puffer wird abgesaugt und die Zellen werden gewaschen, dann lysiert, gesammelt und unter Verwendung von LC-MS auf das Vorhandensein des Testartikels analysiert.

Substratbewertung: Die Aufnahme des Testartikels durch jeden Transporter allein oder in Gegenwart eines selektiven Inhibitors wird mit der Aufnahme durch die Vektorkontrolle nach 2-5-minütiger Inkubation verglichen. Die Aufnahme eines Sondensubstrats durch jeden Transporter allein oder in Gegenwart eines selektiven Inhibitors und durch die Vektorkontrolle wird als Kontrolle durchgeführt.

Inhibitorbewertung: Die Aufnahme eines Sondensubstrats durch jeden Transporter erfolgt allein oder in Gegenwart eines selektiven Inhibitors oder des Testartikels. Die Aufnahme des Sondensubstrats durch die Vektorkontrolle wird ebenfalls als Kontrolle durchgeführt. Wenn eine Hemmung beobachtet wird, kann der IC50 bestimmt werden.

Efflux Transporter Assay
  • Testsystem: Caco-2-Darmendothelzellen des Menschen, kultiviert auf Transwell-Platten in einem angefeuchteten Inkubator bei 37 °C in 5 % CO2 für 21-24 Tage
  • Assay-Puffer: HBSS mit HEPES, pH 7,4 sowohl in apikalen als auch in basolateralen Kammern
  • Der transendotheliale elektrische Widerstand (TEER) wird vor dem Assay gemessen, um die Bildung enger Verbindungen zu bestätigen
  • Testartikelkonzentrationen: 2 für Substrattests, 2 für Inhibitionstests
  • Radiomarkierte Permeabilitätsmarker Mannit und Koffein werden verwendet, um die Bildung dichter Verbindungen zu verifizieren
  • Es werden radioaktiv markierte Sondensubstrate verwendet, die für jeden Transporter spezifisch sind
  • Positive kontrollselektive Inhibitoren für jeden Transporter mit negativen Inhibitorkontrollen

Die scheinbare Permeabilität von Testgegenstand und Sondensubstraten wird sowohl in apikaler bis basolateraler (A-B) als auch in basolateraler bis apikaler (B-A) Richtung auf Transwell-Platten bestimmt. Nach 30 Minuten Vorinkubation in einem Assay-Puffer in einem angefeuchteten Inkubator bei 37 °C in 5 % CO2 wird die Sonde oder der Testgegenstand in eine Kammer (Spender) mit einem Blindpuffer in der gegenüberliegenden Kammer (Empfänger) gegeben. Gegebenenfalls werden dann in beide Kammern Inhibitoren gegeben. Die Platten werden 2 Stunden bei 37 ° C in 5 % CO2 inkubiert. Spender- und Empfängerkammerproben werden gesammelt und unter Verwendung von LC-MS auf das Vorhandensein des Testartikels analysiert. Dann werden die Permeabilität des Testartikels und das Ausflussverhältnis bestimmt.

Substratbewertung: Der Transport des Testartikels allein oder in Gegenwart selektiver Inhibitoren wird in beide Richtungen bestimmt. Der Transport eines Sondensubstrats für jeden Transporter allein oder in Gegenwart selektiver Inhibitoren wird als Kontrolle durchgeführt.

Inhibitorbewertung:  Der Transport eines Sondensubstrats wird nach 2-stündiger Inkubation allein oder in Gegenwart eines selektiven Inhibitors oder des Testartikels in beide Richtungen bestimmt. Wenn eine Hemmung des Effluxtransports beobachtet wird, kann der IC50 bestimmt werden.

Vesikulärer Membranaufnahme-Assay
  • Testsystem: Membranvesikel (50 µg / Well), die den Efflux (ABC) -Transporter BSEP exprimieren.
  • Testgegenstandskonzentrationen: 2 für Substrattests; 2 für Inhibitionsassays.
  • Adenosintriphosphat (ATP)-abhängige Aktivität gemessen, wobei Adenosinmonophosphat (AMP) als Kontrolle verwendet wurde.
  • Radiomarkiertes Sondensubstrat, spezifisch für BSEP
  • Positive Kontrollinhibitoren für jeden Transporter

Membranvesikel, die BSEP und den Testgegenstand oder das Sondensubstrat exprimieren, werden in Platten mit 96 Vertiefungen inkubiert. Die Aufnahme wird durch Zugabe von Adenosintriphosphat (ATP) und anschließende Inkubation für 30 Minuten bei 37 °C eingeleitet. Adenosinmonophosphat (AMP) wird parallel als Negativkontrolle verwendet. Die Aufnahme wird durch Vakuumaspiration und zweimaliges Spülen der Filter mit überschüssigem eiskaltem Transportpuffer beendet. Anschließend werden Vesikel aus Filterplatten extrahiert, um die LC-MS zu quantifizieren und die ATP-abhängige Aktivität zu berechnen.

Substratbewertung: Die Aufnahme des Testartikels allein und mit selektivem Hemmstoff in Gegenwart von ATP wird mit der Aufnahme in Gegenwart von AMP verglichen.  Die Aufnahme eines Sondensubstrats durch BSEP allein und in Gegenwart eines selektiven Hemmstoffs wird als Kontrolle durchgeführt.

Hemmstoffbewertung: Die Aufnahme eines Sondensubstrats erfolgt allein und in Gegenwart eines selektiven Hemmstoffs oder des Testartikels. Die Aufnahme in Gegenwart von ATP wird mit der Aufnahme in Gegenwart von AMP verglichen.  Wenn eine Hemmung der ATP-abhängigen Aufnahme des Testartikels beobachtet wird, kann der IC50 bestimmt werden.

 

Ergebnisse

Diese Assays identifizieren und profilieren Substrat- oder Inhibitionswechselwirkungen mit Membran-Arzneimitteltransportern. Die Daten beschreiben das Ausmaß der Aufnahme und/oder des Ausflusses, die Permeabilität des Testartikels, die Transporterhemmung und gegebenenfalls die IC50-Werte.

Diese Daten können auch verwendet werden, um DDI-Risiken basierend auf wahrscheinlichen Wechselwirkungen mit begleitenden Therapeutika zu bewerten und neue Arzneimittelkandidaten einzustufen. Wenn Wechselwirkungen beobachtet werden, kann die Pharmakometrie​​​​​​​ zusätzliche Hinweise bei der Beurteilung der Notwendigkeit einer klinischen Studie geben.