Nachweis von Phospho-Proteinen in soliden Tumoren mittels Phospho-Durchflusszytometrie

In diesem Artikel stellen wir den Phospho-Protein-Nachweis in soliden Tumoren mittels Phospho-Durchflusszytometrie vor und geben einen Überblick über die Analyse der Cabozantinib-induzierten Hemmung der PI3K/AKT- und JAK-STAT-Signalisierung in Tumor- vs. Wirts-Immunzellen.

Das  in-vivo efficacy of small molecule inhibitors is often assessed by measuring the phosphorylation state of cell signaling proteins within the pathways the drug targets. Dies kann eine Herausforderung sein, wenn die Analyse solider Tumoren notwendig ist. In der präklinischen Forschung sind Immunblot- und ELISA-basierte Techniken unter Verwendung von Nagetiermodellen die häufigsten Ansätze für die Tumoranalyse. Diese Massenanalysemethoden haben jedoch zwei Hauptnachteile. Zum einen ist Ihre relative Fähigkeit, mehrere Ziele gleichzeitig zu messen, nicht optimal. Zum anderen sind sie nicht in der Lage, Ziele in mehreren verschiedenen Untergruppen innerhalb der heterogenen Tumorprobe zu analysieren. Dies kann wichtig sein, wenn das zielsignalisierende Protein in verschiedenen Zelltypen in der Tumormikroumgebung gegensätzliche Funktionen hat, wie beispielsweise bei Immunzellen gegenüber Tumorzellen. Wenn wirkstoffinduzierte Effekte in einer, aber nicht in beiden Untergruppen auftreten, ist es sogar bedeutend.

Labcorp has developed a novel phospho-flow-based platform that simultaneously analyzes multiple cell signaling targets in both the host immune cell and the tumor cell compartments derived from solid tumors. Dies wird erreicht, indem die Tumorzellen vor der Phospho-Protein-Analyse von den infiltrierenden Wirtsimmunzellen durch Immunphänotypisierung für den panhämatopoetischen Zellmarker CD45 unterschieden werden. Um die Nützlichkeit dieser Plattform zu demonstrieren, wurden die Gehalte an phosphoryliertem STAT5 und das Verlaufsziel von AKT (S6) in subkutanen MV-4-11-Tumoren von Mäusen gemessen, die mit dem FLT3-Hemmstoff Cabozantinib behandelt wurden. Abbildung 1 zeigt, dass Cabozantinib die pS6- und pSTAT5-Spiegel in den menschlichen (h)CD45+-Tumorzellen reduziert. In den (m)CD45+-Wirtsimmunzellen der Maus (nicht dargestellt) wurden keine Veränderungen in diesen Phospho-Proteinspiegeln ​​beobachtet. Auf diese Weise erhalten Sie Einblicke in die PI3K/AKT- and JAK-STAT-Signalaktivität. Dies sind gut dokumentierte Signalwege, die sowohl das Tumorwachstum als auch die Immunität des Wirts regulieren und interessante Ziele für therapeutische Interventionen sind.

Abb. 1: Phospho-Durchflussanalyse von STAT5 und MAPK-Signalisierung in soliden Tumoren.

MV-4-11 ist ein Modell für akute myeloische Leukämie (AML), eine Malignität, die durch genetische Mutation in einem von mehreren Genen verursacht wird. Das häufigste Ereignis tritt im FLT3-Gen auf, was zu einem konstitutiv aktiven FLT3-Protein führt, das die Proliferation von Krebszellen durch Auslösen einer Hyperaktivierung von 3K/AKT- and JAK-STAT-Signalisierung antreibt.¹ Es wurde gezeigt, dass eine FLT3-Hemmung durch Cabozantinib das MV-4-11-Tumorwachstum in-vivo hemmt, was mit einer In-vivo-Hemmung der AKT- und STAT-Signalisierung korreliert.² Obwohl in vielen Modellen gut dokumentiert ist, dass überaktive PI3K/AKT and JAK-STAT5-Signalisierung das Tumorwachstum vorantreibt, ist die Aktivität dieser Signalproteine ​​auch für die T-Zell-Aktivierung und die T-Zell-Bildung nötig.^3,4,5 Diese Dichotomie unterstreicht die Bedeutung der gleichzeitigen Analyse von Phospho-Proteinen sowohl in von soliden Tumoren abgeleiteten Immunzellen als auch in Tumorzellen.

Tumor phospho-flow at Labcorp has potential to advance the cell signaling field. Der Phospho-Durchfluss in festem Gewebe von Lungen- und Peritonealtumoren wurde im Jahr 2010 beschrieben.⁶ Seitdem sind Berichte über andere erfolgreiche Ansätze rar. In jüngerer Zeit wurde ein als DISSECT bezeichneter Ansatz mit der Zytometrie gepaart und erfolgreich zur Messung von Phospho-Proteinen in Epithelproben und anschließend kolorektalen Tumoren verwendet.^.7,8Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass diese Ansätze eine Fixierung nach der Gewebeentnahme erfordern, wodurch die Epitope verändert werden können, die von den fluoreszierenden Antikörpern gebunden werden, die sowohl für die Immunphänotypisierung als auch für die Signalanalyse verwendet werden. Dies kann die Datenmenge begrenzen, die die Techniken liefern. Solid tumor phospho-flow at Labcorp does not require fixation, prior to immuno-staining. Dies erleichtert es uns, spezifische Populationen gezielt zu analysieren. Wir arbeiten daran, unsere Möglichkeiten zu erweitern. Die fortlaufenden Bemühungen konzentrieren sich auf die Entwicklung neuer Dienstleistungen bezüglich Phospho-Durchfluss in soliden Tumoren, die die Analyse von durch In-vivo-Behandlung induzierten Effekten in bestimmten T-Zell-Untergruppen und Tumorzellen gleichzeitig ermöglichen.

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Verweise

²Lu, J. W.; Wang, A. N.; Liao, H. A.; Chen, C. Y.; Hou, H. A.; Hu, C. Y.; … & Lin, L. I. (2016). Cabozantinib is selectively cytotoxic in acute myeloid leukemia cells with FLT3-internal tandem duplication (FLT3-ITD). Cancer letters, 376(2), 218-225.

³Vara, J. Á. F.; Casado, E.; de Castro, J.; Cejas, P.; Belda-Iniesta, C.; & González-Barón, M. (2004). PI3K/Akt signalling pathway and cancer. Cancer treatment reviews, 30(2), 193-204.

⁴Rani, A. & Murphy, J. J. (2016). STAT5 in cancer and imCantrell, D. (2002, February).

⁵Protein kinase B (Akt) regulation and function in T lymphocytes. In Seminars in immunology (Vol. 14, No. 1, pp. 19-26). Academic Press.

⁶Lin, C. C.; Huang, W. L.; Su, W. P.; Chen, H. H.; Lai, W. W.; Yan, J. J.; & Su, W. C. (2010). Single cell phospho‐specific flow cytometry can detect dynamic changes of phospho‐Stat1 level in lung cancer cells. Cytometry Part A, 77(11), 1008-1019.

⁷Simmons, A. J.; Banerjee, A.; McKinley, E. T.; Scurrah, C. R.; Herring, C. A.; Gewin, L. S.; … & Irish, J. M. (2015). Cytometry‐based single‐cell analysis of intact epithelial signaling reveals MAPK activation divergent from TNF‐α‐induced apoptosis in vivo. Molecular systems biology, 11(10), 835.