Absolute Zählwerte durch Durchflusszytometrie – maximieren Sie die Genauigkeit Ihrer immunphänotypischen Dateninterpretation

In diesem Tech-Spotlight werden die Prinzipien der absoluten Zählung und die Vorteile vorgestellt, die dieser Service in Kombination mit der Analyse des Tumorimmunphänotyps bietet.

Absolutes Zählen ist eine Anwendung, mit der Wissenschaftler der Durchflusszytometrie die Gesamtzahl der Zellen im Gewebe quantifizieren können und die zur Messung der Tumorinfiltration durch Immunzellen verwendet werden kann. In diesem Tech-Spotlight werden die Prinzipien der absoluten Zählung und die Vorteile vorgestellt, die dieser Service in Kombination mit der Analyse des Tumorimmunphänotyps bietet.

Die Fähigkeit, dynamische Änderungen der Immunantwort in der Tumormikroumgebung (TME) genau zu messen, ist entscheidend, wenn neue immunmodulierende Therapien getestet werden. Während die Konfiguration robuster Immunphänotypisierungs-Panels erforderlich ist, um Teilmengen präzise abzugrenzen, kann die Methode, mit der diese Endpunkte gemeldet werden, die Interpretation der Daten beeinflussen. Eine übliche Anzeige ist „% der CD45⁺-Zellen“, die die relative Verteilung jeder Untergruppe als Prozentsatz der gesamten Immunzellen misst. ^1,2 Diese Methode ist wertvoll, da sie dazu beiträgt, den Effekt der Therapie auf den Anteil der Untergruppen mit unterschiedlichen zu quantifizieren Pro-und Anti-Tumor-Aktivitäten. Beispielsweise zeigt eine Zunahme des Anteils an CD8⁺-T-Zellen mit einer entsprechenden Abnahme der regulatorischen T-Zellen an, dass die Behandlung die regulatorische T-Zell-vermittelte Immunsuppression im TME verringert hat.

Die Verwendung von Verteilungsmessungen als alleinige Anzeige weist jedoch Einschränkungen auf. Dies wird im folgenden Beispiel gezeigt. In dieser Studie wurden CT26-tumortragende Mäuse mit einem Anti-mCTLA-4-Checkpoint-Inhibitor behandelt, der zu einer deutlichen Hemmung des Tumorwachstums führte (Abb. 1). Um den Wirkungsmechanismus zu untersuchen, verwendeten wir zuerst die Durchflusszytometrie, um die Verteilung von Tumor-abgeleitetem CD3⁺ und CD11b⁺-Zellen (T-Zellen bzw. myeloide Zellen) unter den gesamten CD45⁺-Zellen zu profilieren (siehe Abbildung 2). Der Interpretierer könnte aus diesen Daten schließen, dass die CTLA-4-Blockade sowohl eine Zunahme der Anzahl von T-Zellen als auch eine gleichzeitige Abnahme von myeloiden Zellen auslöste. Dies würde darauf hinweisen, dass die mechanistische Aktivität der Behandlung durch eine Zunahme der Anzahl von Antitumor-CD8⁺-T-Zellen sowie eine Kontraktion von immunsuppressiven myeloischen Zellen vermittelt wird. Wie Sie unten sehen werden, wäre diese Schlussfolgerung falsch.

Abb. 1: CT26-Zellen wurden subkutan in die rechte Axilla von Balb/c-Mäusen implantiert. Die Dosierung von n=10 TierenGruppen wurde eingeleitet, als Tumore festgestellt wurden, und das Fortschreiten des Tumors wurde durch Messschiebermessungen überwacht. Antikörperdosen wurden zweimal wöchentlich vor der Probenahme am Tag verabreicht

Die Tandemberechnung der absoluten Zählwerte wird häufig verwendet, um die oben beschriebene Einschränkung zu überwinden. Dieser Endpunkt misst genau die Infiltration von Tumoren durch Immununtergruppen und wird typischerweise als Gesamtzellzahl pro Masseneinheit angegeben.^3-4,5 Wenn die absoluten Zahlen zu der obigen Studie addiert werden, wird klar, dass tatsächlich die gesamte myeloide Zellenanzahl/Gewicht in Gramm der Tumore sich nach einer Anti-mCTLA-4-Therapie nicht änderte (Abbildung 2). Stattdessen wird die beobachtete Abnahme des Anteils myeloider Zellen eher durch den nachgewiesenen Anstieg der absoluten T-Zellzahlen verursacht. Die daraus resultierende Nachricht lautet, dass eine durch die Therapie ausgelöste Änderung der Verteilung einer Zieluntergruppe nicht unbedingt auf eine Änderung der absoluten Anzahl dieser Zellteilmenge zurückzuführen ist und stattdessen als Folge der Expansion oder Kontraktion einer anderen Teilmenge auftreten kann.

Abb. 2: Verteilung gegenüber absoluten Zählmessungen von T-Zellen und myeloischen Zellen in CT26-Tumoren. Statistical analysis was performed using a Student's t-test (*p<0,05).

Die nachgeschaltete immunphänotypische Analyse von Tumor-assoziierten Makrophagen (TAMs) und T-Zellen-Untergruppen unterstreicht weiter den Wert der Einbeziehung von Endpunkten der absoluten Zählung. Wie in Abbildung 3 gezeigt, blieben die absoluten Zahlen unverändert, obwohl die Analyse ergab, dass der Anteil der M2-TAMs im Tumor abnahm. Daher zeigen die absoluten Zählungen im Gegensatz zur anfänglichen Analyse nicht an, dass die Pharmakodynamik von M2 TAM zur Gesamtwirksamkeit in dieser Studie beiträgt. Dies ist eine zuverlässigere Schlussfolgerung auf der Grundlage der verfügbaren Daten. Schließlich löste die Anti-mCTLA-4-Therapie einen Anstieg der absoluten Anzahl sowohl von CD8⁺-T-Zellen als auch von CD4⁺Helfer-T-Zellen aus. Zusammengenommen zeigen diese Daten, wie wichtig absolute Zählungen sein können, um die Gesamtzellzahl für aus Gewebe stammende Teilmengen genau zu quantifizieren.

Abb. 3: Verteilung gegenüber absoluten Zählmessungen von M1- und M2-TAMs, CD8+-T-Zellen und CD4-Helferzellen in CT26-Tumoren. Statistical analysis was performed using a Student's t-test (*p<0,05).

Methodik der absoluten Zählung

Die nachgeschaltete immunphänotypische Analyse von Tumor-assoziierten Makrophagen (TAMs) und T-Zellen-Untergruppen unterstreicht weiter den Wert der Einbeziehung von Endpunkten der absoluten Zählung. Wie in Abbildung 3 gezeigt, blieben die absoluten Zahlen unverändert, obwohl die Analyse ergab, dass der Anteil der M2-TAMs im Tumor abnahm. Daher zeigen die absoluten Zählungen im Gegensatz zur anfänglichen Analyse nicht an, dass die Pharmakodynamik von M2 TAM zur Gesamtwirksamkeit in dieser Studie beiträgt. Dies ist eine zuverlässigere Schlussfolgerung auf der Grundlage der verfügbaren Daten. Schließlich löste die Anti-mCTLA-4-Therapie einen Anstieg der absoluten Anzahl sowohl von CD8⁺-T-Zellen als auch von CD4⁺Helfer-T-Zellen aus. Zusammengenommen zeigen diese Daten, wie wichtig absolute Zählungen sein können, um die Gesamtzellzahl für aus Gewebe stammende Teilmengen genau zu quantifizieren.

Fig. 4: Gating strategy to measure the volume of sample aspirated, absolute counts of total live cells, and live CD45+ cells, using the absolute counting flow panel.

Abbildung 4 zeigt, wie die absoluten Zellenzahlen berechnet werden. Der Wulstbereich quantifiziert die Anzahl der vom Durchflusszytometer erfassten Wülste, um die Messung des abgesaugten Probenvolumens zu ermöglichen. Das Cell Gate wird unter Verwendung eines Lebensfähigkeitsfarbstoffs analysiert, der tote Zellen ausschließt.​​​​​​​ Und nach dem Ausschluss toter Zellen wird die CD45-Expression gemessen, um den Prozentsatz der Zellen zu berechnen, die in das Live CD45+ Cells-Gate fallen. Die Gesamtzahl der vom Zytometer nachgewiesenen CD45⁺-Immunzellen wird dann unter Verwendung der folgenden Formel berechnet. Schließlich kann, da die anfängliche Tumormasse bekannt ist, die Zellzahl/das Gewicht des Tumors in Gramm zurückgerechnet werden.

Der vollständige Datensatz für die obige Studie ist auf Anfrage erhältlich. Er beschreibt Checkpoint-Blockade-Effekte auf die Anzahl und das Profil der folgenden Untergruppen bei CT26-Tumoren sowie die Durchflussfelder, die für diese Messungen verwendet wurden.

• Granulozytische myeloide Suppressorzellen

• Monozytäre myeloide Suppressorzellen 

• Dendritische Zellen

• Tumorassoziierte Makrophagen (M1 und M2)

• B-Zellen

• Natürliche Killerzellen

• Natürliche Killer-T-Zellen

• CD8+T-Zellen

• CD4-Helfer-T-Zellen

• Regulatorische T-Zellen

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Verweise

² Lewis, Katherine E. et al. „Interleukin-21 kombiniert mit PD-1 oder CTLA-4 Blockade verbessert die Antitumorimmunität in Mäusetumor-Modellen.“ Onkoimmunologie​​​​​​​ 7,1 (2018): e1377873.

³ Muroyama, Yuki et al. „Stereotaktische Strahlentherapie erhöht funktionell supprimierende regulatorische T-Zellen in der Tumormikroumgebung."​​​​​​​ Krebsimmunologieforschung 5,11 (2017): 992.

⁴Balza, Enrica, et al. “The therapeutic T‐cell response induced by tumor delivery of TNF and melphalan is dependent on early triggering of natural killer and dendritic cells.” European journal of immunology 47,4 (2017): 743-753.